Análisis Genético del Caballo Criollo Venezolano

E.G. Cothran, J.L. Canelon¹, R. Juras, C. Luis, E. Conant

Texas A&M University, College Station, Texas, USA

¹Universidad Centro-Occidental Lisandro Alvarado, Barquisimeto, Venezuela

Introducción

El Caballo Criollo Venezolano (CCV) es considerado una raza local y su cría se inicia con la fundación de la ciudad de Coro, fundada en 1526 por el Regente de Santo Domingo, Juan de Ampíes. En 1528 los gobernadores Welsares fueron licenciados por el rey de España, Carlos V para importar caballos de la Española (Santo Domingo), San Juan (Puerto Rico) y Santiago (Cuba) a Venezuela. Aunque la mayoría de los caballos que en aquellos días vinieron a Venezuela eran de origen Antillano, se sabe que vinieron caballos directamente de España, traídos por los Welsares o por colonizadores. No existe Stud Book ni censo de los CCV, ejemplares de los estados Apure, Aragua y Mérida son fenotípicamente similares y el cruce con otras razas es raro por la baja sobrevivencia y adaptación a las difíciles condiciones de las áreas donde el CCV es utilizado. Algunos estudios preliminares del CCV fueron hechos por De Armas (1946). Actualmente la atención hacia esta raza se ha incrementado y esfuerzos por su conservación, futuras estrategias de cría y planes de manejo son guiados por la Cátedra Libre para el Estudio y la Conservación del Caballo Criollo Venezolano de la Universidad Centro-Occidental Lisandro Alvarado. La caracterización genética de las poblaciones puede ser un instrumento útil para la conservación de las razas, puede influir en las futuras estrategias de cría y planes de manejo. El estudio genético utilizando Microsatélites se ha convertido en uno de los marcadores genéticos más populares. Ha sido exitosamente aplicado en la verificación de paternidad, prueba de relaciones genéticas entre caballos, además ha servido para investigaciones de variabilidad genética entre razas e internamente de la misma raza, tanto en poblaciones de caballos domésticas como ferales (ej: Canon et al. 2000, Bjornstad et al.,2000, Juras et al. 2003, Tozaki et al. 2003, Aberle et al. 2004, Solis et al. 2005, Luis et al. 2006, Plante et al. 2007) Materiales y Métodos Se tomaron muestras de pelos de 214 CCV en los Estados Apure 161, Mérida 42 y Aragua 11 respectivamente. Muestras de dos razas ibéricas Andaluz 30 y Sorraia 30 porque fueron identificados por Luis et al. (2007) como parte del mismo grupo (grupo c). El panel para la tipificación del ADN consistió en 15 Microsatelites: AHT4 y AHT5 (Binns et al., 1995), ASB2, ASB17 (Breen et al. 1997) ASB23 (Lindgren et al., 1998) HMS2, HMS3, HMS6, y HMS7 (Guerin et al., 1994), HTG4, HTG6 (Ellegren et al., 1992) HTG7, HTG10 (Marklund et al., 1994), LEXX33 (Coogle et al., 1996) y VHL20 (Van Haeringen et al., 1994). Se realizó amplificación de microsatélites en múltiples reacciones de PCR en 25 µL de volumen total conteniendo 30 ng de ADN genómico, 0.07 a 0.8 µM de primers, 1 x PCR buffer (Perkin Elmer), 2,5 nM MgCl2, 0.2 nM dNTP y lU Ampli Taq (PE Applied Biosystems, MA). Para la amplificación de microsatélites  las plantillas de ADN y primers se combinaron y calentaron a 95°C por 10 minutos. Luego la temperatura se bajo y mantuvo a 85°C por 10 minutos, para la adición de los reactivos remanentes. Treinta y dos ciclos de 1 minuto a 95°C, disminuyendo a 58°C por 30 segundos y 72°C por 30 minutos; luego una extensión final a 72°C por 30 minutos. Los productos de la reacción se analizaron usando un secuenciador de ADN ABI 377 (Applied Biosystems, Foster City, CA. USA). El tamaño de los fragmentos se determinó utilizando el software STRand (Hughes, 2000). La frecuencia de alelos, la información polimórfica contenida (PIC) y el promedio de probabilidad de exclusión (PE) se calculó con el software Cervus 2.0 (Marshal et al., 1998). La variabilidad genética se midió por la heterozigosis observada (Ho), esperada (He) y heterozigosis esperada sin sesgo (Hu) (Nei, 1978), numero efectivo de alelos (Ne) y número total de variantes encontradas en cada población (Na). La diferenciación genética entre poblaciones (Ф_{PT y} F_st) y la varianza de los componentes de  la diversidad de los microsatélites, dentro y entre las poblaciones para todos los pares de la población, fueron analizados por varianza molecular (AMOVA) Set de permutaciones a 999 en GENALEX 6 (Paekall and Smouse, 2006) .Salidas de equilibrio en concordancia con la ley de Hardy-Weinberg se probaron con GENEPOP 4.0 (Raymound and Rousset, 1995). Se utilizó el procedimiento secuencial de Bonferoni, para tener múltiples pruebas simultáneas (Rice 1989). F-estadísticas y coeficiente de diferenciación genética G_ST (Nei, 1973) se calcularon usando GENETIX 4.02 (Belkhir et al.,2004) La distancia chord Dc (Cavalli-Sforza and Edwards, 1967) y la distancia Nei´s Da (Nei et al. 1983) se calcularon con el software POPULATIONS 1.2.28 (escrito por Olivier Langella). La distancia basada en la proporción de alelos compartidos (POSA) (Bowcock et al. 1994) se calculó utilizando Analizador de Microsatelite (Dieringer and Shlotterer, 2003). Los arboles fueron visualizados por Treeview (Page, 1996) o Splits Tree4 (Huson y Bryant, 2006) dependiendo del método de distancia utilizado. La estructura de la población se acceso por los métodos de grupos Bayesianos en STRUCTURE 2.2 (Ritchard et al., 2000) y el software BAPS 5.3 (Corander et al., 2008). El modelo con mezcla y correlación de frecuencias de los alelos y 10 replicaciones independientes se realizaron en cada corrida (K entre 2 y 13) usando un periodo de quemado de 20.000 seguido por 100.000 MCMC repeticiones con el software STRUCTURE.  La similitud entre corridas se computarizaron por CLUMPP (Jakobsson and Rosenberg., 2007). Se utilizo el software DISTRUCT 1.1 (Rosenberg, 2004) para mostrar gráficamente los resultados generados por STRUCTURE. Se utilizó el software GENECLASS 2.0 (Piry et al., 2004) para la prueba de asignación y exclusión de la población y calcular la probabilidad del origen de cada individuo y cada muestra aplicando 10.000 individuos simulados y un error tipo I de 0.01Resultados. Se detectaron 126 alelos en los loci de los 15 microsatelites, con promedio de 8.4 por locus y un rango de 4 a 16 alelos. El HTG6 tuvo menor diversidad (0.626), el AHT4 mayor diversidad (0.836) y el mayor numero de alelos fue observado en el ASB17. No se observó desviación significativa, según expectativas de la ley de Hardy-Weinberg.

Tabla 1. Sumario estadístico de las razas analizadas utilizando marcadores microsatélites. Tamaño de la Muestra (N) Observados (Ho), Esperados (He) y Heterozis esperada sin sesgo (UHe), Heterozigosis deficiencia (Fis), Número total de de variantes encontrados en cada población (Na) y Numero efectivo de alelos (Ne)                                                                                                                            

Se encontraron algunos alelos raros en toda la data, pero en baja frecuencia. Todos los loci fueron altamente informativos para la raza del CCV con valores de PIC mayores que 0.5 (Botstein et al. 1980). La probabilidad de exclusión paterna usando este set de microsatélites fue de 99.96%. El resultado de AMOVA mostró que 16% de la variación originada entre las razas de caballos y 84% procedía de las poblaciones. (F_PT = 0.0160 P = 0.010). Los valores de Fis, Fit y Fst fueron 0.014, 0.090 y 0.077, respectivamente. El coeficiente de diferenciación genética (G_ST) tuvo un valor de 0.097. Entre las razas suramericanas los valores fueron Fis 0.014, Fit 0.073 y Fst 0.059. Los valores de diferenciación genética entre pares de razas suramericanas fue de 3.3% entre CCV y Chilote (3.6% entre CCV y Paso Fino Colombiano) a 13.3% para el Criollo Argentino y Paso Fino Puertorriqueño. El valor de Fst para todos losloci entre las 10 razas suramericanas de caballos fue de 0.059, lo que indica que 5.9% de la variabilidad puede atribuirse a la diferencia entre ellas. También se buscó si había alguna evidencia de diferenciación genética entre las tres poblaciones de CCV muestreadas (Apure, Aragua y Mérida).El valor de Fst entre estas tres poblaciones fue de 2.2% comparada con el 5.9% entre razas suramericanas, aunque las muestras de Mérida y Aragua fueron pequeñas, sin embargo, un número mayor de muestras probablemente no alteraría los resultados significativamente. Las probabilidades de asignación individual, basadas en los métodos de Bayesianos con un remuestreo utilizando Monte Carlo, revelan que solamente 74.7% (481 individuos de 644) pueden ser correctamente asignados a su población de origen. Para el CCV 182 de 214 individuos fueron correctamente asignados (85%). El análisis STRUCTURE muestra que series independientes desde K=2 a K=13 producen resultados consistentes. Un plano con el agrupamiento de los individuos se presenta en la fig. 1. K = 3 indica la presencia de dos grupos claramente, uno perteneciente al Sorraia y otro al Caballo de Paso Puertoriqueño. De K = 4 en adelante, la asignación de los individuos refleja la presencia de una estructura poblacional asociada a una diferenciación genética progresiva. En K = 7 todos los caballos criollos muestran alto grado de similitud excluyendo al CCV. Similar patrón se observó para las razas de Paso donde el Puertorriqueño está más aislado. El análisis Bayesiano de la estructura genética de la población utilizando el software BAPS revela que el óptimo de divisiones es 8 de 13 poblaciones y la relación de vecindad de éstas está representada en el árbol de la Fig. 2 (No mostrada) Los árboles filogenéticos basados en la distancia Cord, el logaritmo de la proporción de alelos múltiples, (POSA) y el Fst  produjo árboles con topologías similares al árbol basado en la distancia Nei´s Da presentado en la Fig.1. La comparación del CCV con otras razas suramericanas indica una relación cercana al caballo puertorriqueño de Paso (Fig.1). Cuando separamos el CCV en los componentes de los estados Apure, Mérida y Aragua, todos se agrupan juntos (información no mostrada), reafirmando que no hay subestructura en su población. Discusión. El CCV muestra altos niveles de diversidad parecidos a otras poblaciones domésticas analizadas (ver Bjornstadet al. 2000, Arbele et al. 2004, Leroy et al. 2009) y desde el punto de vista de la conservación, no existe un riesgo inmediato de perder esta variación, a menos que la población disminuya drásticamente. La Variación Genética atribuida a las diferencias ente razas suramericanas fue de un 5.9% del total de la variación y el remanente 94.1 % pertenece a la variación entre individuos, algo menor al 12% observado en razas noruegas (Bjornstad et al., 2000), 10% en caballos franceses (Leroy et al. 2009)  y el 8 % en razas de caballos españoles (Canon et al. 2000), y mayor que 1.5% reportado para razas nativas del sur de Europa, esto puede ser atribuido al limitado material genético traído al Nuevo Mundo. Utilizando un amplio radio de razas y diferentes métodos de agrupación, el CCV consistentemente se agrupa con las razas suramericanas y se agrupa mas con los caballos Paso Fino que con otros criollos (Fig.1) Esto no sorprende porque los archivos históricos indican que los primeros caballos que llegaron a Venezuela, Colombia y Perú fueron traídos de las Islas del Caribe: República Dominicana, Cuba y Puerto Rico (Del Rio Moreno 1992). Resultado similar se observó en un estudio del Caballo Criollo Uruguayo, donde se encontró una cercana relación con el caballo Peruano de Paso, Berberisco y Paso Fino, más que con el Pura Raza Española (Kelly et al. 2002). Aunque no hay información histórica de la introducción de caballos Berberiscos en América, los autores proponen que la raza pura española fue cruzada repetidamente en España con diferentes razas durante los siglos XVI-XVIII y el actual caballo Berberisco (como se mantuvieron sin cruces) es más parecido al viejo tipo de la Pura Raza Española (Kelly et al. 2002), Cuando el CCV se separa en las tres subpoblaciones de los estados Apure, Mérida y Aragua, ellos se agrupan en la misma rama y no muestran diferenciación.

Figura 1.  Árbol de Relación de cercanía basado en la distancia de  Nei’s Da.

  

El CCV aparece fenotípicamente y genotípicamente muy uniforme. Utilizando análisis Bayesiano se obtiene que el Sorraia siendo muy consanguíneo, forma un grupo único bien definido, en tanto que, el CCV es difícilmente asignado a un solo grupo. Igual resultado se observa para los Appaloosas y Hanoverianos (Plante et al. 2007), indicando que son altamente variables. Similares resultados se obtuvieron en caballos Franches_Montagnes (Glowatzki-Mullis et al. 2005), caballos de la Isla Sable (Plante et al. 2007), Pantaneiro (Sereno et al. 2008) y en varias razas criadas en Francia (Leroy et al. 2009).Un reciente estudio de diversidad en cabras reveló niveles moderado de diferenciación genética (7%) y una baja asignación individual a las razas de origen – 74.9%  (Canon et al. 2006). La proporción de asignación correcta de los individuos fue correlacionada con el valor de Fst  y negativamente correlacionada con heterogozidad  (Canon et al. 2006). Un resultado similar se encontró en este estudio del CCV. El CCV es una raza única, bien adaptada a las condiciones locales y ambiente difícil, como es típico de otros criollos en Sur América. La población actual parece suficientemente grande para sostener la relativa alta diversidad genética encontrada actualmente en la raza. Sin embargo, las estrategias futuras de cría, registros genealógicos, manejo y planes de conservación deben establecerse para esta raza para asegurar que esa variación pueda ser mantenida si las circunstancias para la raza cambian.Reconocimiento los autores desean agradecer a los criadores de caballos criollo venezolano por permitirnos recoger las muestras para este trabajo.

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Trabajo efectuado por : E.G. Cothran, , R. Juras, C. Luis, E. Conant
Texas A&M University, College Station, Texas, USA.
J.L. Canelon, Universidad Centro-Occidental Lisandro Alvarado, Barquisimeto, Venezuela.

Escrito por: José Luis Canelón Pérez. MV. MSc, UCLA. Barquisimeto, Estado Lara. Derechos Reservados de Autor.
Publicado en Jinete y Caballo http://jineteycaballo.blogspot.com/p/analisis-genetico-del-caballo-criollo.html